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尾气在线检测分析在发酵中的应用

时间:2018-04-17  来源:山东省科学院生物研究所  作者:sws2605384  浏览次数:200
 

原文已发表在《发酵科技通讯》2012.10,第414P32-35

尾气在线检测分析在发酵中的应用

刘仲汇,史建国,朱思荣,扬艳,高广恒,李雪梅

山东省科学院生物研究所,山东省生物传感器重点实验室,山东济南,250014

摘要:通过尾气在线检测分析可获取发酵过程重要的呼吸代谢参数CER,OUR,RQ等。这些参数反映了微生物的代谢状况,无论对动力学研究还是优化工艺、全面控制发酵过程、提高产量产率都具有重大意义。本文综合论述了其在发酵各方面的应用。

关键词:发酵;尾气; CO2;O2;CER;OUR;RQ

0 引言

发酵中尾气组分浓度变化反映了整个发酵过程物质的变化情况。特别是尾气中CO2和O2的变化,包含了非常有价值的过程反应信息。CO2是细胞呼吸和分解代谢的终产物,还是某些合成代谢的基质。几乎所有发酵均产生大量CO2。CO2的产生是一种重要的生长指标,特别适用于早期生长阶段。在对数生长期CO2的释放在一定条件下与细胞量成正比。监测CO2的生成是跟踪生长活动的有效方法。氧是构成细胞本身及代谢产物的组分之一。对于好氧发酵,无论是基质的氧化、菌体的生长或是产物的代谢均需要大量的氧[1-2]

通过发酵尾气中的CO2及O2在线检测分析,可以获取发酵过程重要的呼吸代谢参数,如CO2释放速率(CER)、摄氧率(OUR)、呼吸商(RQ)等。这些参数反映了微生物的代谢状况,尤其能提供从生长向生产过渡或主要基质间的代谢过渡指标。CO2释放率(Carbon-dioxide Escape Rate ,CER)是指单位时间、单位体积发酵液细胞释放的CO2量。摄氧率(Oxygen Uptake Rate, OUR)是指单位时间、单位体积发酵液细胞消耗的氧。OUR取决于菌体浓度,也与发酵液的营养成分、溶解氧水平、菌体的生长速率以及碳源的种类和浓度等因素有关。CER除以OUR所得的商称为呼吸商(Respiratory Quotient,RQ)。呼吸商是各种碳源在发酵过程中代谢状况的指示值。在碳源限制且供氧充分的情况下,各种碳源都趋向于完全氧化,呼吸商应接近于其理论值。而供氧不足时,碳源不完全氧化,可使呼吸商偏离理论值[3-5]

目前发酵尾气CO2O2检测分析技术已日臻成熟。其性能稳定,可靠性高,可实现连续在线检测。因是从尾气取气分析,对发酵无任何影响;也无需高温灭菌,故为其应用创造了有利条件。

近年来,尾气分析在发酵中的应用研究越来越广泛深入。这些对于深入研究发酵过程机理,摸索、优化发酵工艺,全面控制发酵过程具有重大意义;尤其在基因工程、生物制药领域,能够大大加快新品研发及产业化,稳定生产,提高产率。

1 发酵过程状态识别

微生物发酵是个复杂的生化过程。在宏观上表现为整个发酵过程的有规律性,即一般都经过迟滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期。然而由于诸多因素的影响,又使各个发酵阶段与具体的时间关系表现为无规律性。这给发酵过程的准确控制带来困难。因此正确辨识发酵各个阶段对于过程优化控制具有重要意义。

研究表明,无论对于霉菌、酵母菌、细菌,单液相体系、双液相体系,纯种发酵、混合菌发酵,CER的变化与体系状态的变化有着密切联系,根据CER的变化规律可以有效、准确地把握发酵过程。李强等对青霉素、古龙酸、二元酸和葡萄糖酸发酵四个体系CER的变化规律进行研究,分析了CO2释放与发酵各个阶段的关系,证明CER用于过程判断及控制是可行的[6]李元广等在十三碳烷烃生产十三碳二元酸发醉中发现随着菌体生长,CER不断增大,当菌体生长基本停止时,CER达到最大值,然后便开始下降。据此可以通过CER来及时确定进入产酸期的最佳时间,即CER达到最大值时[7]

杨强大等利用在线检测OUR对特定发酵阶段的比生长率进行预估,再利用预估值进行发酵阶段的在线辨识,并应用于100L诺西肽发酵。依据辨识得到的发酵阶段为0~13h为延迟期, 13~38 h为指数生长期,38 h以后为稳定期。该结果与实际过程相一致。这种估计方法无延迟,非常适合在线应用[8]

间歇发酵放罐时机的准确识别对提高产量和产率,降低能耗和成本有实际意义。傅春生等利用在线检测的尾气CO2变化率、DO变化率,辅以离线检测的总糖浓度变化率、氨基氮浓度变化率及pH,并根据某抗生素生产数据,建立了该发酵过程放罐时机识别与预报模型及计算机实时识别系统。5批实验表明模型判断比人工更及时,且模型判断的产量对于发酵终点的相对值高于人工判断[9]

安居白等依据尾气CO2O2DO等在线参数,运用Bayes数据融合计算菌体生长状态概率,建立了在线识别菌体生长状态的柠檬酸发酵控制专家系统,在1.5 m3试验罐上提高产物对底物的比近十个百分点[10]

2 优化供氧

对于好氧发酵,为确保生产菌获得适量的溶氧,将溶氧控制在临界氧浓度之上即可。这样既避免了细胞因供氧不足发生代谢异常,也可避免过度供氧引起的能量消耗和对细胞可能的伤害。根据OUR的变化可以很方便确定临界氧浓度。其原理是:当发酵罐在一定操作系统下,体积传氧系数Kla保持恒定时,随着OUR上升,DO呈下降趋势,当OUR下降,则DO上升,OUR与DO存在相反的变化趋势。而当DO降到临界氧浓度以下时,OUR随DO的下降而下降。由于发生在此变化的时间内,菌体浓度变化可忽略,OUR的变化可看做是呼吸强度(即比耗氧速率)的变化。所以如果存在OUR与DO变化一致的阶段,即为溶解氧低于临界值的阶段,从而可确定此时的临界氧水平。

戴剑漉等在30L发酵罐上研究了必特螺旋霉素基因工程菌发酵中OUR、CER及DO等参数变化的相关性,发现当DO与OUR的趋势具有相反性时,限制因素为细胞水平的菌体代谢问题;若DO与OUR的趋势具有同一性, 限制性因素为工程水平的氧传递因素,表明溶氧处于临界氧以下;并据此判断发酵前期临界氧浓度应在25%,为其发酵放大工艺研究提供了依据[11]

通气量的调节很多是凭借经验。在安装溶氧电极时可根据临界氧来调控。谌颉在阿维菌素发酵中用尾气数据进行通气量控制,发现在产素期当通气量由1600 m3/h降到1400 m3/h时,CER、OUR立即开始下降,RQ则是先升后降,说明供氧对代谢的限制已经显现。后来测定的产素速率也在此时下降。以此确定产素期通气量临界值为1600 m3/h[12]

3 指导流加补料

流加发酵可在系统中维持很低的基质浓度,从而避免发生阻遏效应,并按设备能力维持适当供氧,减缓代谢有害物的不利影响。因而可对发酵过程进行控制,提高生产水平。利用尾气在线检测分析可以合理控制流加时间、流加速率,进而实现流加的反馈控制。

   Cooney曾基于CO2总释放量的积分,推导出精确的菌体量,据此来控制糖的流加速率[13]

陈冠胜等根据多批青霉素生产测得的CER, 采用模糊控制技术,在青霉素生产期将CER作为控制参数进行补糖。该控制算法能针对菌丝的瞬间代谢情况流加糖,使菌丝对糖的利用能力大大加强,效率提高了10%左右[14]

   固定化酵母发酵中,载体的存在使葡萄糖扩散受阻。如不能对糖浓度变化快速反应,载体中的细胞就会出现缺糖现象。这种体系的特殊性也很难用估计糖浓度的方法来进行预测。潘小飞利用CER和CO2释放量来估计载体内菌体对糖的饥饱程度,从而控制葡萄糖流加速率,使乙醇连续平稳地生产,平均转化率为0.42g乙醇/g葡萄糖[15]

生物量预测及预估

CER是呼吸代谢参数,与生物生长有密切联系,可用来估计生物质浓度和产物浓度。而且这种估计的是反应活性生物质浓度或产物浓度,排除了培养基固体成分和死细胞的干扰。K Gbewonyo等人在800 L反应器上,曾研究利用在线的CER数据估计前期的菌体生长量,并且取得良好的对应关系[16]. 姜长洪等在50 m3谷氨酸发酵罐上利用CER在线估算菌体量,并用实测数据进行校正,使估算值接近实际值,同时运用先进的过程控制策略,对谷氨酸发酵的主要参数进行控制,运行后糖酸转化率稳定提高,产酸率提高1.5%[17]

Horiuchi等在大肠杆菌分批培养中,用尾气CO2来估算细胞、葡萄糖、乙酸的浓度和比生长速率[18]

桑海峰等基于在线检测OUR,提出了一种比生长率与生物量浓度的在线连续估计方法。在诺西肽发酵应用中,估计值与实验值吻合度好[19]

固态发酵已广泛应用于生物农药、饲料等行业,但生物量的测定是面临的问题。在液态发酵容易做到的生物量离线测定,在此也因无法使菌体与培养基分离难以获得。利用CO2在线检测是比较有效的方法。张洁等人在木霉T6固态发酵产淀粉酶及产木聚糖酶中,分别研究了CO2与淀粉酶及木聚糖酶活力的关系,发现尾气中CO2浓度曲线与比淀粉酶活力曲线变化一致,且同时达到最大值;而木聚糖酶的合成与CO2含量之间存在滞后关系, CO2浓度在发酵26h达到最高值,木聚糖酶活力在39h才达峰值。说明尾气CO2含量变化可以作为固态发酵某些产物合成的研究参数[20-21]

5 作为研究优化发酵工艺的手段

   尾气检测分析目前已经成为优化发酵工艺非常有效的手段。

庄英萍等在50L发酵罐上进行梅岭霉素的发酵过程研究,通过对OUR、CER、RQ及氧传递系数等进行在线检测及相关分析,对原工艺不断调整,实现了梅岭霉素发酵的初步优化,使发酵效价从原来的150 u/ml提高到520u/ml,为实现其工业化规模生产奠定了基础[22]

   朱校适等在50L发酵罐上进行了克拉维酸发酵过程温度控制优化试验,分别将全程温度控制在24℃、26℃、28℃。通过对发酵各阶段的CER、OUR和RQ进行对比分析,发现温度对棒状链霉菌的生长和代谢有重要影响,降低对数生长期发酵温度可明显缓解前期供氧不足的矛盾,进而提出了发酵过程的变温控制,使克拉维酸的产量由原来3950mg/L提高到4500mg/L,增产11.5%[23]

在谷氨酸发酵中,控制CO2固定反应与乙醛酸循环的比率,对谷氨酸的产率影响尤为关键。杨玉岭等人试验合理控制CO2排放量, 使CO2含量处于既维持菌体正常呼吸,又确保更多的CO2固定, 从而提高发酵转化率。试验结果,6m3罐将CO2控制在7~8%比不控制提高转化率1.81%;75 m3罐控制在8~9%,提高转化率1.4%[24]

6故障预判

发酵过程周期长,投入大。特别是对于工业发酵,可以通过尾气在线检测参数较早发现异常,及时补救,将损失降至最低。

谌颉在阿维菌素发酵中发现非正常批次OUR的特征:OUR明显偏高,菌体快速生长阶段出现的OUR首个峰值超过对照批次约25%,且在100 h前数值基本都高于正常批次20 mol/m3.h。而非正常批次的产素速率仅为对照批次的50%左右。这是由于呼吸强度过高,菌体初级代谢过旺,虽用于合成的原料增加,但出于竞争关系,最后进入合成途径的反而减少,甚至因为初级代谢物的阻遏作用而完全抑制合成途径,所以造成产素速率低下。这样就可以通过前期的OUR及时发现问题,进行补救[25]

董传亮等采用OUR、CER、转速、氨水耗量及细胞浓度,构建成基于自我联想神经网络5-6-2-6-5的AANN网络,进行故障诊断和故障处理,优化得到的AANN网络可以对谷氨酸发酵进行及时、准确的故障预判,从而为排除故障、尽可能快地恢复发酵性能提供信息[26]

7帮助判断是否染菌

在线检测CO2可以监视发酵过程是否染菌。姜长洪等对谷氨酸发酵过程的研究发现,在正常通风情况下,若CO2浓度迅速下降,说明发酵罐内污染了噬菌体;若CO2浓度不断上升,超出正常规律,则有可能污染了杂菌[27]

8 结束语

综上所述,尾气分析技术在发酵领域应用取得了可喜成就,相信随着技术的进步,相关设备的普及,应用研究会更加深入,并进一步推动生物产业发展。

参考文献

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